4-Way Recombineering (4WR)

大肠杆菌 GB05-dir的新应用

4路重组（4WR）提供了一种新的快速且简化的方法，可在单个体内重组步骤中从多达四个DNA片段（例如PCR产物）组装质粒。通过将所有片段共电穿孔到Gene Bridges的流行的大肠杆菌染色剂GB05-dir（目录号K008）中，这被促进  。

4WR系统极大地补充了CRISPR / Cas9等现有技术。近年来，CRISPR / Cas9已成为真核染色体编辑的首选系统。有许多精心设计的策略以惊人的精确方式通过指导RNA和突变Cas9核酸酶处理基因组位点。但是，当涉及等位基因交换，基因融合或蛋白质标签操作时，构建相应供体载体的方法仍是传统方法，因此既费时又费力。贝克及其同事令人印象深刻地展示了4向重组的力量（2016年，《自然科学报告》第 6期（25529），他使用4WR快速构建了具有短同源区域（〜1 kb）的供体载体。这样的构建体对于单等位基因应用（例如荧光蛋白标签，靶向雄性Y染色体或杂合靶向）非常有效。简单技术的这种组合称为重组和Cas9辅助标记 （RAC-tagging）。

4WR的应用还扩展到实验室标准操作，例如克隆特定成分不同的完整质粒系列，例如驱动恒定报告基因的启动子文库，或交换抗生素抗性标记或蛋白质标签。由于4WR在设计上是模块化的，因此执行此类任务非常容易。

结合较早开发的直接克隆（DC）技术，4WR还可以处理大部分DNA，例如整个基因簇。在最初的DC步骤中从基因组DNA亚克隆的操纵子可以在随后的4WR操作中轻松地与非天然启动子或蛋白质标签结合。